Una nuova analisi quantitativa mirata di X

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 12856 (2023) Citare questo articolo

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Le analisi di inattivazione del cromosoma X (XCI) spesso aiutano nella diagnosi dei tratti legati all'X, tuttavia una valutazione accurata rimane difficile con i metodi attuali. Abbiamo sviluppato una nuova strategia utilizzando l'arricchimento Cas9 senza amplificazione e il sequenziamento delle tecnologie dei nanopori di Oxford chiamata XCI-ONT, per indagare e quantificare rigorosamente l'XCI nel gene del recettore degli androgeni umani (AR) e nel gene della retinite pigmentosa 2 umana legata all'X (RP2). XCI-ONT misura la metilazione su 116 CpG in AR e 58 CpG in RP2 e separa i cromosomi X parentali senza bias PCR. Mostriamo l'utilità della strategia XCI-ONT rispetto alla tecnica XCI standard dorato basata sulla PCR che indaga solo uno o due CpG per gene. I risultati evidenziano i limiti dell'utilizzo della tecnica golden standard quando il modello XCI è parzialmente distorto e i vantaggi di XCI-ONT per quantificare rigorosamente XCI. Questo studio fornisce un metodo XCI universale sul DNA, che è di grande valore nel quadro clinico e di ricerca dei tratti legati all'X.

L'inattivazione del cromosoma X (XCI) è un meccanismo di compensazione per la differenza nel numero di cromosomi X tra maschi (46XY), femmine (46XX) e individui con aneuploidie X1. Il meccanismo dell'XCI molecolare umano non è completamente compreso2,3 ma gli studi hanno dimostrato che l'XCI è controllato da fattori ad azione cis e trans nel centro di inattivazione dell'X (Xic), inclusa l'espressione genica del trascritto specifico dell'X inattivo (XIST) e geni del trascritto specifico X-attivo (XACT)3. Ciò alla fine porta all'espressione monoallelica e all'accumulo di H3K27me33 e alla metilazione dei siti CpG vicino ai promotori dei geni sul cromosoma X inattivo (Xi) (Fig. 1A)4,5,6. La metilazione ha dimostrato di essere importante per il mantenimento dello stato inattivo di Xi7,8,9,10. L'XCI negli esseri umani inizia nella fase iniziale dell'impianto embrionale3 e la scelta di quale cromosoma X inattivare è in generale descritta come un processo casuale, in cui entrambi i cromosomi X sono ugualmente rappresentati11,12. Tuttavia, è stato osservato che l'inattivazione preferenziale di un cromosoma X, il cosiddetto XCI asimmetrico, modifica la manifestazione della malattia legata all'X nelle femmine portatrici, indicando che il genotipo è importante nella scelta del cromosoma X attivo (Xa), possibilmente mediante selezione cellulare dovuta a uno svantaggio della cellula mutante13,14,15,16. In primo luogo, il silenziamento preferenziale dell'allele patogeno è stato associato ad una sopravvivenza femminile selettiva o ad un effetto meno grave dei tratti legati all'X. È stato dimostrato che l'asimmetria estrema è un buon indicatore della presenza di varianti patogene legate all'X nelle femmine portatrici15,17,18 e le analisi XCI nei parenti familiari quindi spesso aiutano nell'interpretazione delle varianti legate all'X. In secondo luogo, l'espressione dell'allele patogeno può portare alla manifestazione di fenotipi nelle femmine portatrici di tratti legati all'X19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 e può spiegare le differenze fenotipiche osservate nelle femmine portatrici affette e individui con aneuploidie X21,24,29,30,31,32,33,34,35,36. Da notare che si raccomanda di eseguire le analisi XCI nei tessuti rilevanti, a diverse età e nei non fumatori37,38,39,40,41,42,43,44. In generale, la definizione di asimmetria è stata > 80:20 ma a causa delle limitazioni della tecnica golden standard utilizzata per l'analisi XCI, la quantificazione dell'asimmetria non è stata raccomandata per silenziamenti diversi da 100:0, evidenziando la necessità di un metodo quantitativo .

(A) Schema del meccanismo di inattivazione del cromosoma X e del suo effetto nelle femmine portatrici di tratti legati all'X. Blu: cromosoma X attivo (Xa), rosso: cromosoma X inattivo (Xi), stella gialla: variante patogena legata all'X. Illustrazioni create utilizzando Adobe Illustrator 2022 (disponibile su https://adobe.com/products/illustrator). (B) I metodi XCI standard aureo utilizzano enzimi di restrizione sensibili alla metilazione (HpaII) che tagliano Xa ma lasciano Xi intatto. HpaII prende di mira rispettivamente due e un sito CpG nel recettore degli androgeni (AR) e nella Retinis pigmentosa 2 (RP2), ed è seguito da PCR e analisi della lunghezza dei frammenti (FLA) che abbracciano regioni polimorfiche ripetitive (CAGn o GAAAn) che separano gli alleli parentali. Illustrazioni create utilizzando Adobe Illustrator 2022 (disponibile su https://adobe.com/products/illustrator). L'approccio XCI-ONT taglia il DNA indipendentemente dallo stato di metilazione utilizzando l'arricchimento CRISPR-Cas9 con tre gRNA (rosa) che fiancheggiano una regione di interesse (ROI) di ~ 3 kb che si estende su 116 siti CpG in AR e 58 siti CpG in RP2. (C) XCI-ONT include: (1) Defosforilazione delle estremità 5' per ridurre la legatura degli adattatori di sequenziamento ai filamenti fuori bersaglio. (2) Il sistema CRISPR-Cas9 si lega e taglia la ROI e il DNA è dotato di coda dA per la legatura dell'adattatore ai lati tagliati Cas9, che sono sia 3' coda dA che 5' fosforilati. (3) La libreria viene sequenziata utilizzando Oxford Nanopore Technologies e l'identificazione delle basi Bonito. (4) Chiamare le ripetizioni allineando le letture ai genomi di riferimento contenenti tutte le possibili ripetizioni nelle regioni e le letture vengono divise in aplotipi tracciando il numero di letture con ripetizioni diverse. Infine, l'identificazione e la quantificazione della metilazione vengono eseguite utilizzando Nanopolish e i dati vengono visualizzati utilizzando Integrative Genomics Viewer (IGV). Viene calcolata la metilazione media della ROI e viene determinato il rapporto XCI tra i due cromosomi X.

80:20), often used in the interpretation of X-linked variants. In addition, quantification can be very useful when XCI is modifying disease e.g. in the investigation of carrier females presenting symptoms due to expression of the pathogenic allele (incomplete silencing). Approaches for quantifying the levels of XCI on the maternal and paternal allele have been proposed before but this requires either bisulfite conversion and PCR50 or paired RNA and DNA sequencing data of the XIST gene using informative transcribed heterozygous single nucleotide variants (SNVs) to separate the parental alleles41,51. A SNV is not as informative as repeated elements and can therefore not be used to distinguish between individuals. This highlights the need for a universal quantitative XCI analysis on DNA to be used for research applications and clinical diagnostics related to X-linked traits./p> T;p.(Arg1190Cys), NM_004606.4) where carrier females had ~ 100:0 skewed XCI when investigating the AR gene57. The XCI result was confirmed in this study by investigating the RP2 locus of two asymptomatic carrier females (IV:8, III:10) and one asymptomatic non-carrier female (III:7) (Supplementary Fig. 1). The two asymptomatic carrier females presented a ~ 100:0 skewed XCI status consistent with the maternal X-chromosome being silent (carrying the pathogenic variant). The asymptomatic non-carrier female had expression of both alleles i.e. a random XCI status, however the method presents variable result between experiments and contrasting results in the different genes (63:37 in AR vs. 47:53 in RP2). In addition, three females (female I, II and III) were investigated using the golden standard method. All individuals showed different ratios of XCI for both AR (female I 62:38, female II 47:53 and female III 81:19) and RP2 (female I 81:19, female II 60:40 and female III 87:13) (Table 1, Supplementary Fig. 2)./p> 80:20), often assisting in the interpretation of X-linked variants. In addition, quantification can be highly useful in the investigation of carrier females manifesting symptoms due to expression of the pathogenic allele. Quantification of XCI can illuminate the mechanism of disease, and provide useful information for improving prenatal risk assessment36, diagnostics and treatment development of X-linked traits. Lastly, we would like to illuminate the possibility that different disorders and pathogenic variants requires different levels of expression to develop symptoms and stress the use of a quantitative XCI investigation to answer these questions. A related application for XCI-ONT is monitoring pharmacological Xi reactivation, which has been suggested as treatment for X-linked disorders due to skewed XCI59,60,61,62./p> T;p.(Arg1190Cys) variant in the TAF1 gene (NM_004606.4)57. DNA from two carrier females (III:10, IV:8) and one non-carrier female (III:7) as well as three unrelated females (female I-III) was included in the current analysis./p> 20). The data were visualized by plotting the number of reads (y-axis) containing any repeat in the range of 5–40 repeats in AR or 5–30 repeats in RP2 (x-axis) (Supplementary Fig. 3). The reads were divided into haplotypes based on the repeat count and comparison with the golden standard results. Methylation calling and calculation of the methylation frequency was performed using Nanopolish software package (version 0.12.0). Only sites with a log-likelihood ratio > 2.5 (methylated) or < − 2.5 (unmethylated) were included in the methylation analysis (Supplementary Fig. 5). Bam-files were converted using the “converting bam for igv” package66 and the methylation status was visualized using Integrative Genomics Viewer bisulfite mode CG (version 2.10.0). The XCI status was established by using the average methylation frequency in the chrX:67543761–67546170 region (AR gene, 116 CpG sites, hg38) and chrX:46836539–46837273 region (RP2 gene, 58 CpG sites, hg38) followed by calculating the ratio of the average methylation between the alleles in each gene./p>

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